تهيه واكسن ويروسي

اولين واكسيناسيون عليه ويروس 200 سال پيش انجام گرفت. اما در مواقع واكسيناسيون در مقابل ويروس در اواخر قرن 19 صورت گرفته است. امروزه عليه بسياري از ويروس ها واكسن تهيه مي شود. واكسن هاي ويروسي به دو صورت تهيه مي شوند: اول به طريق ويروس زنده ضعيف شده و دوم به وسيله پلي ساكاريد و كپسيد ويروسي كه در اين حالت سيستم ايمني تحريك مي شود ولي بيماري به وجود نمي آيد. براي كشت و توليد فراوان ويروس از حيوانات و تخم مرغ و يا كشت سلولي استفاده مي شود.

لازم به تذكر است براي كشت ويروس، تخم مرغ، سلول ديپلوئيد انسان و سلول كليه سيمون بايد كاملاً استريل و عاري از هر گونه آلودگي ويروسي باشند. براي پيشگيري از آلودگي باكتري معمولاً به محيط كشت سلولي آنتي بيوتيك اضافه مي شود. پس از اينكه ويروس ها در محيط هاي فوق ازدياد گرديد، به وسيله روش هاي مختلف مثل تجزيه، صافي هاي ستوني و سانتريفوژهاي جداسازي و غيره از محيط هاي كشت مربوطه جدا شده، سپس مراحل خشك (ليوفيليزه) تهيه كرده، قبل از تزريق به وسيله حلال مربوطه به فرم مايع در آمده و سپس تزريق مي نمايند. براي ضعيف كردن ويروس آن را چندين بار در محيط كشت سلولي و يا حيوان انتقال مي دهند و اين عمل را آنقدر تكرار مي كنند تا ويروس بدست آمده داراي ويرولانس مناسب انسان باشد. همچنين براي تضعيف آن ها از فرمالدئيد و يا پروپيولاكتون استفاده مي شود و اين كار باعث مي شود كه خاصيت بيماريزايي ويروس ازبين برود، ولي خاصيت ايمني زائي آن باقي بماند. از نور uv (ماوراء بنفش) و يا حرارت نيز براي از بين رفتن خاصيت بيماريزايي ويروس استفاده مي شود.

دوام و قدرت يك مايه ويروسي را به وسيله آزمايش ها و اصلاحات بين المللي زير تعيين مي نمايند.

1- از روش مقدار ويروسي كه محيط كشت سلولي را آلوده نموده است و به عبارت ديگر مقدار ويروسي كه 50 درصد عفونت در كشت سلولي ايجاد نمايد.

2- از روي مقدار ميكروگرم ايمني زايي، مثل مايه هاي هپاتيت و آنفلونزا.

3- از روي شمارش تعداد ويروس در هر ميلي ليتر، مثل مايه آبله

4- از روي قرار دادها و يا واحدهاي بين المللي مثل مايه هاري كه به وسيله آزمايش روي موش انجام مي گيرد.

5- از روي درجه مسموميت روي موش نيز يك مايه ويروس مورد آزمايش قرار مي گيرد.

مثلاً براي تهيه مايه ويروس آنفلونزا، ويروس را در جنين تخم مرغ كشت و تكثير مي دهند. پس از تكثير مايع آلانتوئيك را كه حاوي ويروس تكير شده است با محلول فرمالين و يا به كمك اشعه uv غير فعال و ويروس را جدا و خالص سازي مي نمايند و سپس به آن يك ماده محافظت كننده اضافه مي كنند. در اين حالت مايع حاصل ذره كامل ويروس و يا به صورت ويروس خرد شده مي باشد.

براي تهيه مايه فلج اطفال زنده خوراكي، اين ويروس را در سلول هاي كليه ميمون و يا محيط سلول هاي ديپلوئيد انسان تكثير مي دهند، ولي ويروس ها را با آلدهيد فرميك از بين نبرده بلكه آن ها را تضعيف مي نمايند. از اين رو مايه خوراكي را نبايد هرگز از راه تزريق بكار برد. ويروس هاي زنده ضعيف شده هنگامي كه وارد روده شوند؛ توليد مثل مي نمايند و باعث ايجاد تحريك و توليد پادتن اختصاصي (IgA) عليه ويروس مي شوند.

تهيه واكسن باكتري

گونه باكتري هايي كه در تهيه اين مايه ها بكار مي روند بايد طوري انتخاب شوند كه حداكثر قدرت ايمني زايي را داشته باشند. تجربه نشان داده است كه خاصيت ايمني زائي گونه هاي صاف (كه كلني آن ها به علت وجود كپسول ها در آن ها حالت صاف دارد) از گونه هاي خشن (بدون كپسول) مي باشد. گاهي ممكن است ميكروب هايي كه بطور ذخيره نگهداري شده اند خاصيت ايمني زائي خود را از دست بدهند. براي تهيه مايه هاي ميكروبي چندين مرحله وجود دارد.

1- داشتن ميكروب بيماريزا

2- تكثير اين باكتري در شرايط مناسب

3- جداسازي باكتري هاي بيماريزا از محيط كشت

4- غير فعال كردن ميكروب ها با حرارت، فرمالوئيد، فنل و يا اشعه ماوراء بنفش

5- انجام بازرسي براي دانستن اينكه آيا ميكروب ها كشته شده اند و شمارش ميكروب ها

اگر عمل كشته شدن خوب انجام شده باشد، هيچ ميكروبي رشد نخواهد كرد.

6- رقيق نمودن محلول سوسپانسيون و تقسيم در آمپول ها.

ولي بطور كلي واكسن هاي باكتري به سه طريق تهيه مي شود:

1- توكسين         2- آنتي ژن             3- جسم سلولي

توليد واكسن باكترياي از توكسين باكتري:

واكسن توكسوئيد در بيماري هايي مانند كزاز، ديفتري و قانقاريا بكار برده مي شود. براي تهيه توكسين باكتري به عنوان واكسن بايد ابتدا سويه مولد توكسين را در محيط مصنوعي حاوي عصاره گوشت يا كازئين و يا سويا كشت داد.

براي توليد ماكزيمم توكسين، بايد در محيط آمينو اسيدهاي مختلف، ويتامين ها و عصاره مخمر وجود داشته باشد و براي تهيه توكسين هاي مشخص لازم است تا يون هاي معدني متعدد به مقدارهاي دقيق وجود داشته باشد. مثلاً وجود آهن در توليد توكسين ديفتري و كزاز به مقدار جزئي ضروري است. توليد توكسين حين رشد، مي تواند با انواع تكنيك ها دنبال شود، مانند اندازه گيري فعاليت آنزيم هايي مثل لسيتيناز، هموليز و پروتئوليزو به درجات پايين تر تأثير توكسين روي خوكچه هندي، موش، خرگوش بصورت Invivo و مشاهده مرگ يا جراحات پوستي. توكسين هاي باكتريايي معمولاً به وسيله فرمالدئيد غير فعال مي شوند كه تا حدي باعث از بين رفتن خاصيت ايمني زائي توكسين نيز مي شود. توكسوئيدها با آزمايش TCP، استاندارد مي شوند، آزمايش TCP بر اساس خنثي سازي مقدار ثابتي از آنتي توكسين به وسيله يك سري دوزهاي متفاوت توكسوئيد است.سپس آنتي توكسين غير فعال شده با مقدار ثابتي از توكسين كه برابر نصف آنتي توكسين بكار رفته است ، مخلوط مي شود و سري هاي مخلوط شده به موش ها تلقيح مي شوند و موش ها به مدت 2 روز نگهداري مي شوند. مخلوط حاوي توكسوئيد كه نصف موش هاي تلقيح شده را بكشد همان دوز ثابت توكسين مورد نظر است.

در مورد كورينه باكتريوم ديفترينه، ابتدا توكسين خالص سازي مي شود و سپس تبديل به توكسوئيد مي گردد . براي خالص سازي توكسوئيد از سديم بي كربنات، ذغال فعال و سولفات آمونيوم استفاده مي گردد.

توليد واكسن هاي حاوي آنتي ژن هاي سلولي

آنتي ژن هاي سلولي به دو نوع ديواره سلولي و كپسول تقسيم بندي مي شوند. در گذشته، بيشتر اين گونه واكسن ها حاوي سلول هاي غير فعال شده اي بودند كه بر اساس تعداد سلول ها استاندارد مي شوند.

اخيراً سعي شده است تا آنتي ژن هاي مهم ديواره باكتري ها با استفاده از محيط رشد اختصاصي براي توليد آنتي ژن هاي خاص تهيه شوند. خالص سازي اين آنتي ژن ها موجب رفع مشكل سميت مي شود.

ديواره سلول باكتري هاي گرم منفي پيچيده تر از باكتري هاي گرم مثبت مي باشد و حاوي تركيبات اندوتوكسيني است كه علت سميت واكسن هاي تهيه شده از سلول هاي كامل باكتري هاي گرم منفي مي باشد.

روش غير فعال سازي بستگي به آنتي ژني دارد كه مورد نياز براي تهيه واكسن مي باشد. آنتي ژن هاي K (كپسول ) كه حساس به حرارت هستند را مي توان با فرمالدئيد يا حرارت ملايم ( C  60ْ به مدت 1 ساعت) غير فعال كرد.

خالص سازي آنتي ژن نيز مشكل است. مثلاً آنتي ژن هاي K بعد از جداسازي ارگانيسم ها به وسيله سانتريفوژ، از مايع رويي خالص مي گردند. در مواقعي كه آنتي ژن ها هنوز متصل به سلول هستند، لازم است كه ارگانيسم ها جمع آوري شوند كه مي توان آن ها را با سانتريفوژ كردن محيط تخميري يا از سطوح جامد جدا كرد.

در ضمن مقدار آنتي ژني كه براي تهيه واكسن بكار مي رود بايد تعيين شود براي آنتي ژن ها سلولي، استاندارد كردن معمولاً بر اساس تعداد ارگانيسم ها در واحد حجم محيط كشت مي باشد.

هنگام خالص سازي واكسن هاي پلي ساكاريدي مقدار آنتي ژن بر اساس اندازه گيري وزن خشك تعيين مي شود.

تهيه واكسن از سلول هاي زنده ضعيف شده

ايمني زايي ناشي از واكسن هاي زنده ضعيف شده عموماً بيشتر از ايمني زايي واكسن هاي غير فعال شده مي باشد. واكسن هاي زنده ضعيف شده، به درجاتي در ميزبان تكثير مي يابند و مقدار آنتي ژن قابل دسترس سيستم ايمني را افزايش مي دهند. اين واكسن ها معمولاً بصورت ليوفيليزه آماده مي شوند و براي تزريق در يك حلال مناسب حل مي شوند. اشكال هايي هنگام توليد واكسنهاي زنده ضعيف شده وجود دارد كه عبارتند از:

زنده ماندن ميكروارگانيسم ها هنگام ليوفيليزه و پايداري سويه هاي موتانت. در مورد پايداري، بايد سويه ها دائماً از نظر برگشت احتمالي به حالت بيماريزايي كنترل شوند. براي سويه هاي ايجاد كننده ي كلني خشن سالمونلا دوبلين و سالمونلا كلراسوئيس مي توان ميزان صاف بودن كلني ها و يا ميزان بيماريزايي در حيوانات كوچك را به عنوان معيار پايداري بكار برد.